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不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪的三大效应

时间:2022-04-21 来源网站:张家界化工机械网

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪的三大效应

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪是在电泳体系中采用两种以上的缓冲液成分、pH和凝胶孔径,其中不连续盘状凝胶电泳较为常用。在不连续盘状凝胶电泳中存在样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应和电荷效应三大效应,由于这三种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。一、浓缩效应:1、凝胶层的不连续性:(1)样品胶:为大孔胶,采用光聚合法制备。样品预先加在其中,起防止对流的作用,避免样品跑到上面的缓冲液中。目前电泳一般不制作此胶。(2)浓缩胶:为大孔胶,采用光聚合法制备。起防止对流的作用,样品在其中浓缩,并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面处浓缩成薄层。(3)分离胶:为小孔胶,采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离,起防止对流的作用。蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小,移动速度快。进入小孔凝胶时受到的阻力大,移动速度减慢。由于凝胶层的不连续性,在浓缩胶与分离胶的界面处使样品浓缩,区带变窄。2、缓冲液离子组成的不连续性:在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向移动,其迁移率不同,两种离子若能形成界面,则跑在前面的离子称为快离子(前导离子),跑在后面的离子称为慢离子(尾随离子)。为了使样品达到浓缩的目的,需在缓冲液中加入有效迁移率不同的两种离子,并使这两种离子在缓冲液中组成不连续的两相,即在三层凝胶中加入快离子,在电极缓冲液中加入慢离子。为了保持溶液的电中性和一定的pH值,需加入一种与快、慢离子电荷符号相反的离子,称为缓冲配对离子,使缓冲配对离子分布于全部缓冲液中,即三层凝胶缓冲液和电极缓冲液中。如分离蛋白质时,通常采用氯离子(Clˉ)为快离子,甘氨酸根离子((NH2CH2COOˉ)为慢离子,三羟甲基氨基甲烷(Tris+)为缓冲配对离子。电泳开始前,慢离子位于两个电极槽中,快离子分布于三层凝胶中,样品在样品胶中,缓冲配对离子分布于全部缓冲液中。电泳进行时,快离子与慢离子的界面向下移动。由于选择适当的pH值缓冲液,使蛋白质的有效迁移率介于快、慢离子之间,而浓缩成为极窄的区带。当样品到达浓缩胶与分离胶的界面处时,离子界面继续前进,蛋白质被留在后面,然后被分成多个区带。3、缓冲液pH的不连续性:在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性是为了控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率,要求在样品胶和浓缩胶中,慢离子比所有被分离样品的有效迁移率都低,使样品夹在快离子与慢离子的界面之间被浓缩。而在分离胶中,慢离子的有效迁移率比所有被分离样品的有效迁移率都高,使样品不再受离子界面的影响。电极缓冲液pH = 8.3,甘氨酸的电离小,有效迁移率小。浓缩胶中的氯离子完整电离,有效迁移率大。蛋白质在浓缩胶中介于快、慢离子之间。电泳开始后,氯离子跑得较快,留下一低电导区,产生高电位梯度,使甘氨酸根离子追赶氯离子,蛋白质夹在中间被压缩。4、电位梯度的不连续性:在不连续体系中,电位梯度的差异是自然形成的。电泳开始后,由于快离子的迁移率较大,会很快超过蛋白质,在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。由于电导与电位梯度成反比,低电导区的电位梯度较高。高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的有效迁移率与电位梯度的乘积分别相等时,则三种离子的移动速度相同。快、慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后,在快、慢离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面,即在高、低电位梯度区之间形成一个迅速移动的界面,由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,因此就聚焦在这个移动的界面附近,被浓缩成一个狭小的中间层。二、分子筛效应:离子界面到达浓缩胶与分离胶的界面处时,凝胶的pH变化明显,缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加,有效迁移率超过蛋白质,随之高电位梯度消失,蛋白质在均一的电位梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质的相对分子量和构象不同时,通过分离胶所受到的阻力不同,因迁移率不同而被分开。凝胶这种分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力,这种现象称为分子筛效应。三、电荷效应:蛋白质在浓缩胶与分离胶的界面处被高度浓缩,堆积成层,形成一狭小的高浓度的蛋白质区带,但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同,因而迁移率不同。承载有效电荷多的,移动速度快,反之则慢。因此各蛋白质以一定的顺序排列成多个圆盘状。综上所述,样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行,分子筛效应和电荷效应主要是在分离胶中进行。在蛋白质进入分离胶时,由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面,高电位梯度消失,使蛋白质进入均一的电位梯度和pH的分离胶中。此时,又由于分离胶的孔径小,各蛋白质因分子大小和形状不同而被阻滞的程度不同,使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。

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